Las enzimas de restricción son enzimas que cortan tanto el ADN monocatenario como bicatenario. Cada enzima de restricción tiene una secuencia de nucleótidos específica, llamada sitio de restricción, que reconoce y corta. Las enzimas de restricción se usan para la secuenciación del ADN, el análisis mutacional y la clonación y amplificación del ADN. Los científicos usan enzimas de restricción para REPLACEar genes de interés en vectores de expresión, moléculas de ADN que pueden replicarse por separado del ADN cromosómico. El vector que contiene el gen de interés puede luego introducirse en una cepa bacteriana para la expresión y caracterización de proteínas.
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Paso 1
Identifique sitios de enzimas de restricción en su vector mirando un mapa de restricción. El mapa de restricción le dirá qué enzimas cortan su vector y dónde.
Paso 2
Elija una enzima de restricción que también tenga un sitio presente en su inserción génica, observando la secuencia del REPLACEo. Asegúrese de que el sitio de restricción esté en una posición en su REPLACEo que esté fuera del gen de interés, para que no pierda ninguna parte del gen.
Paso 3
Asegúrese de que no haya duplicados del sitio de restricción en ninguna parte de su REPLACEo genético o vector. Esto causará cortes múltiples en su ADN y le dará datos engañosos.
Paso 4
Intenta elegir enzimas de restricción que corten con extremos pegajosos, en lugar de extremos romos. Los extremos pegajosos se producen cuando la enzima corta el ADN bicatenario de forma escalonada, dejando un saliente monocatenario que facilita la unión con un corte REPLACEado de la manera opuesta. Los extremos romos se producen cuando el ADN bicatenario se corta de manera suave, y estos son más difíciles de unir.
Paso 5
Elija una enzima de restricción diferente para ambos extremos de su inserción para asegurarse de que esté REPLACEada en el vector en la orientación correcta y para asegurarse de que el vector no se vuelva a unir a sí mismo.
Paso 6
Intenta elegir dos enzimas de restricción que funcionen bien en el mismo sistema de buffer y temperatura. Si esto no es posible, ejecute cada digestión por separado.
Cosas que necesitará
- Secuencia de inserción de genes
- Mapa de restricción para el vector de elección
- Lista de enzimas de restricción y sus sitios de corte
Consejos
- Algunos programas web se han desarrollado para identificar sitios de restricción en una secuencia de ADN rápidamente. Uno de esos programas es de New England BioLabs.
